糖类药物的制备方法

文|明月故人寻

前言

下文展示了利用流动化学系统进行连续的多糖水解和糖标记，以辅助现有的多糖结构分析方法。

在流动系统中，多聚糖的酸性水解可以被加速。醛糖和α-酮酸型糖在60℃下用萘-2，3-二胺有效标记10分钟，分别形成荧光萘并咪唑和喹喔啉酮衍生物。

然后，通过使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱、液相色谱质谱和核磁共振,纳米标记的衍生物改进了其母糖的结构测定和组成分析。

此外，该方案被用于从六种可能的排列中确定m3-糖的SA–Gal–Glc序列。

碳水化合物分析对于在生物研究和生物技术生产中使用聚糖至关重要，一聚糖的一级结构不仅由单糖组成决定，还由其连接和分支决定。

这通常需要确定非葡聚糖取代基的性质和位置，如配糖体和酯(如乙酸酯、硫酸酯和磷酸酯)。还需要解决聚糖三维结构的方法。

分析聚糖结构的方法

多聚糖的结构和组成分析通常需要水解来释放单糖，其中酸性水解是最常用的。

现在也出现了许多用于糖水解的水解方案，单糖分析通常采用液相色谱、质谱、核磁共振或这三种技术的任意组合。

此外，释放的单糖可以衍生化，以便于通过LCA分析进行检测和定量，合适的衍生化也有助于提高MS分析的电离效率。

毛细管电泳质谱，液相色谱-质谱联用仪，17–19andNMR20,21可用于确定复杂聚糖的结构，并通过NADA标记得到显著改善。

我们先前已经探索了一种使用萘-2，3-二胺将醛糖和α-酮酸型糖衍生为它们相应的萘并咪唑和喹喔啉酮衍生物。

用NADA衍生葡萄糖和唾液酸。

通过还原末端的还原胺化作用来转化醛糖，是为质谱分析提供衍生物的常用方法，然而，需要去除产品中高含量的盐以提高信号水平，利用还原胺化共轭α-酮酸是无效的，因为两种异构体的反应性和产率低。

相比之下，Nam和QXO糖易于制备，有助于在色谱和光谱分析中进行母糖的结构鉴定，还原糖可能以α-和β-异头物的环状形式存在，这有时是不明显的一核磁共振信号。

糖-NAIM衍生物消除了核磁共振分析中的这一障碍，我们之前已经表明，NAIM衍生化为单糖和二糖的定量NMR分析提供了一种简单的方法，包括阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖，普通-乙酰半乳糖胺、葡萄糖醛酸、麦芽糖和乳糖。

每种糖的NAIM衍生物在不同的位置显示出单一的特征乙烯基H-2质子，以便于定量分析。

这种方法特别适用于多种聚糖的鉴定和定量分析，此外，糖链上带有一个疏水的NAIM基团，可以增强质谱检测中的电离。

紫外和荧光活性NAIM改进剂也有助于LCA分析，在使用荧光检测器时，糖-NAIM化合物的检测极限可能达到亚摩尔范围。

衍生自普通单糖的糖，包括核糖、Ara、Xyl、Rha、岩藻糖、Glc、Man、Gal、GalNAc、GlcUA和半乳糖醛酸，使用硫酸化-α-环糊精作为手性选择剂，在无涂层熔融石英毛细管上进行拆分。

微反应器的使用极大地促进了NAIM衍生化，从而缩短了反应时间并提高了产率，用于多步合成许多其他生物活性化合物和天然产物的流动化学系统，优化产量并有助于安全。

在流动系统中结合聚糖降解和糖衍生，以及使用色谱、质谱和核磁共振技术，可以实现快速的碳水化合物成分分析。

在流动化学系统中制备糖-NAIM衍生物的方法

在流动化学系统中制备糖NAIM的方法是从分批制备法改进而来的，Vapourtec easy-MedChem流动化学系统中的标记过程流程图如下图所示：

在流动化学系统中制备糖-NAIM衍生物的图解。冰醋酸显示为水蓝色。背压调节器。

所有溶液都在冰醋酸中:小瓶A，NADA；vialB，糖样品和小瓶C，碘。

通过以相同的速率泵送溶液A、B和C来进行反应。15.0毫克，0.08毫摩尔的单糖、30.0毫克，0.18毫摩尔的NADA，和3.8毫克，0.03毫摩尔的碘，最终量在60°C下进行10分钟。

反应完成后，用减压旋转蒸发浓缩混合物，得到所需的糖-NAIM衍生物，将其直接进行一无需进一步纯化的H-NMR和LC-MS分析，该反应方案适用于制备其他糖-NAIM衍生物，包括混合糖、寡糖和聚糖的衍生物。

流动化学系统中的聚糖水解设置图如所示

流动化学系统中的聚糖水解图。对于120和150℃的反应，背压调节器的表压分别设置为3和4巴。

小瓶A含有100毫克的聚糖，dd-H2o，100 mL的双蒸水溶液和含有8 M HCl溶液。

小瓶B被制备用于聚糖水解，通过在10分钟内以相同的0.5毫升/分钟的速率在不同的温度下泵送溶液A和B来进行反应。

这产生了10.0 mL的水解体积，在4 M HCl中具有5.0 mg的聚糖浓度。

反应完成后，通过减压旋转蒸发浓缩溶液，得到聚糖水解产物，直接进行一无需进一步纯化的H-NMRand LC-MS测量，这个反应方案也适用于其它聚糖的水解。

在流动化学系统中制备糖-NAIM衍生物

我们先前已经通过在磁力搅拌的烧瓶中用NADA和碘处理醛糖，以分批方式制备了一系列糖-NAIM衍生物。

该反应通常在室温下3-6小时内完成，增加NADA和碘的浓度，使用NAIM标记试剂盒后，反应时间减少到1-2小时，使用流动化学系统进一步改善了标记反应。

在典型的程序中，将30.0毫克，0.18毫摩尔的NADA在HOAc溶液、15.0毫克，0.08毫摩尔的单糖在溶液和3.8毫克，0.03毫摩尔的碘在HOAc 中的溶液混合，并在流动系统中以1毫升/分钟的流速在60℃下反应10分钟。

获得所需的糖-NAIM产物，并在减压下浓缩以除去乙酸，产品由以下人员进行分析一无需进一步纯化的核磁共振氢谱、飞行时间质谱和液相色谱质谱。

以D-葡萄糖为例，在流动系统中，在25℃下5分钟内，Glc-NAIM衍生物的形成约为20 %，在20分钟内基本完成，反应时间在60℃下缩短10分钟，得到基本完全的反应。

流动化学系统中不同时间和温度下的气液色谱-NAIM形成: A表示25°C时5分钟，B表示25°C时10分钟，C表示25℃下20分钟，以及D表示在60℃下10分钟一核磁共振氢谱。

葡萄糖的α-和β-异头物分别在δ 5.22和4.64处显示出异常的H信号，Glc-NAIMderivative在δ 5.38和4.39处显示出特征性的C2和C3质子。

下图显示了包括D-Glc、D-Gal、D-GlcUA、L-Fuc、D-Man和D-Xyl在内的各种单糖通过在流动系统中与NADA和碘在60℃下混合10分钟而有效地转化为它们相应的NAIM衍生物。

这种流动化学方案适用于制备寡糖和高级聚糖的纳米衍生物，尽管需要较长的约20分钟的反应时间。

在流动化学系统中，60°C下10分钟形成各种糖-NAIM衍生物。

15.0毫克，0.08毫摩尔的单糖、30.0毫克，0.18毫摩尔的NADA 和3.8毫克，0.03毫摩尔的碘的最终量用于每次NAIM标记反应。

一核磁共振氢谱以通过它们的C-2质子来表征糖-纳米衍生物:Glc-NAIM在δ 5.38，Gal-NAIM在δ5.54，GlcUA-NAIM在δ 5.39，福克-NAIM在δ 5.61，曼-NAIM在δ 5.18，Xyl-NAIM在δ 5.27。

流动化学系统中的聚糖水解

我们首先研究了二糖、三糖和四糖在流动化学体系中的酸性水解。

根据产物混合物的MALDI-TOF-MS分析，在流动系统中用4 M HCl在80℃下处理麦芽糖10分钟，以引起部分水解，水解在较高温度下加速，并在10分钟内完成。

麦芽三糖的酸性水解进一步支持了温度效应，流动系统中用4 M HCl在25℃下处理麦芽三糖10分钟，得到15%的葡萄糖和30%的麦芽糖，而剩余55%的麦芽三糖。

水解速率随着反应温度的升高而增加，120℃下酸处理10分钟后，95%的麦芽三糖被水解，得到65%的葡萄糖和30%的麦芽糖。

较大尺寸的糖似乎会减慢水解速率，用4或2 M HCl在120℃处理10分钟后麦芽三糖的水解效率相比麦芽三糖的水解在较低浓度的HCl中明显减少。

因此，较高寡糖如麦芽四糖的水解最好用4m HClat 120℃进行。

反应10分钟后，根据MALDI-TOF-MS分析，获得麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖(30%)的混合物，在更长的水解时间后发生进一步降解，只有葡萄糖和麦芽糖作为钠离子被观察到m/z分别为202和365。

然后，我们研究了在流动化学系统中含有两种不同单糖组分的二糖的降解。

当普通糖类具有相同的分子量时，它们很难被MS区分，带脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱通常用于通过强碱洗脱直接分离和检测糖类成分。

相比之下，传统的反相高压液相色谱更容易分离糖成分的适当衍生物，如阿苏加-NAIM化合物，此外，高效液相色谱可以与质谱联用，用于分析预先衍生化的低聚糖。

对于多聚糖成分分析，从多聚糖水解中获得的单糖被再循环到流动系统中，以生成糖-NAIM衍生物，即使在低样品负载下也是如此。

制备的糖-NAIM衍生物通过减压旋转蒸发浓缩，并通过LC-MS分析，无需进一步纯化。

以乳糖为例，葡萄糖和半乳糖组分是在流动化学系统中通过水解获得的，NADA标记后，通过LC-MS分析Glc-NAIM和Gal-NAIM衍生物。

残留物在C18毛细管柱上分离，并通过LTQ-FTMS，标记NAIM发色团，使用波长为330 nm的紫外检测器很容易检测到保留时间为13.3和13.9分钟的Glc-NAIM和Gal-NAIM。

NAIM衍生物显示出比它们的母体糖更高的疏水性，从而显示出增强的ms信号，同量异位素异构体Glc-NAIM和Gal-NAIM都显示质子位于m/z319。

GM3是组织中常见的鞘糖脂，碳水化合物部分是一种三糖，包括唾液酸、半乳糖和葡萄糖，GM3-糖在流动系统中用4 M HCl在120°C下水解10分钟，水解产物用MALDI-TOF-MS。

Glc和Gal显示钠化的分子离子在m/z203，而信号在m/z291归因于SA消除了一个水分子。

相比之下，信号在m/z365归因于Gal-glcd二糖的信号比在m/z453归因于SA-半乳糖二糖，这一结果表明，如预期的那样，唾液酸糖苷键对酸处理更敏感。

除了成分分析，GM3-糖的裂解物在流动化学系统中被浓缩并用NADA标记以获得相应的nai和QXO衍生物。

LC-MS分析显示四种Glc-NAIM、Gal-NAIM、Lac-NAIM和SA-QXO分别出现在13.54、13.96、13.18和14.01分钟。

Glc-NAIM、Gal-NAIM和Lac-NAIM显示了[M + H]+离子在m/z319、319和481，而SA-QXO表现出[M–H]−离子在m/z430。

最重要的是，通过与lc图中真实样品的保留时间进行比较，确定了Lac-NAIM，而不是Glc-Gal-NAIM，其结构由一核磁共振光谱测定法。

实验得出的结论是Glc部分在还原端，SA部分在非还原端，这两个部分与Gal连接形成SA-Gal-Glc三糖，这项研究因此提供了一个碳水化合物测序的例子。

结语

在这项研究中，我们证明了在流动化学系统中，聚糖水解和糖标记被加速。

这种新方法通过结合使用液相色谱、质谱和核磁共振技术，改进了亲本聚糖的结构测定、组成分析和可能的测序。

应用流动化学系统进行连续多聚糖水解和nada标记可以辅助现有的多聚糖测序方法，此时，westill使用微摩尔量的聚糖样品。

然而，当先进的仪器可用时，人们应该能够用更少量的聚糖进行该实验方案，为了完成聚糖测序，必须阐明每个单糖组分的连接位置和异头构型。这仍然是一项具有挑战性的任务。